da Leadership Medica n. 274 del 2009

Abstract

L'insufficienza renale acuta sta diventando un'emergenza per la salute pubblica dato il continuo aumento della sua incidenza e la mancanza di efficaci terapie farmacologiche. Lo sviluppo di terapie cellulari per ricostruire organi o tessuti danneggiati potrebbe rappresentare un'alternativa per questi pazienti. Ci sono evidenze nei modelli animali e nell'uomo che le cellule provenienti da distretti diversi dal rene soprattutto dal midollo osseo possano partecipare al riparo del danno. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che le cellule mesenchimali staminali isolate dal midollo osseo di topo sono in grado di migliorare la funzione e la struttura del rene danneggiato quando iniettate in topi con insufficienza renale acuta. Le cellule mesenchimali staminali si localizzano nel rene dove differenziano in minima parte in cellule epiteliali tubulari ma soprattutto promuovono la proliferazione e riducono l'apoptosi. La rigenerazione mediata dalle cellule mesenchimali staminali passa attraverso un meccanismo paracrino legato alla produzione, da parte delle cellule mesenchimali staminali, del fattore di crescita insulin-like growth factor-1. Anche le cellule mesenchimali staminali isolate dal midollo umano sono efficaci nel trattamento dell'insufficienza renale acuta da cisplatino in topi immunodeficienti e contribuiscono a migliorare la perfusione del rene preservandone la struttura dei capillari.

Introduzione

L'interesse suscitato dalle cellule mesenchimali staminali (MSC) si è notevolmente accresciuto negli ultimi anni a seguito del ruolo prominente che queste cellule hanno assunto nella rigenerazione dei tessuti.
Le MSC sono state isolate dal midollo osseo dove hanno la funzione di produrre la matrice stromale e di contribuire alla maturazione e alla crescita dei progenitori ematopoietici. Le MSC inoltre danno origine ad osteociti, condrociti e adipociti (Bianco et al., 2001). Diversi studi hanno documentato che le MSC da midollo hanno una notevole plasticità in quanto possono differenziare, sia in vitro che in vivo, in tipi cellulari diversi dal loro tessuto d'origine (Jiang et al., 2002) e di generare cardiomiociti (Toma et al., 2002), cellule neuroectodermiche (Kopen et al., 1999) e cellule epatiche (Schwartz et al., 2002).
In un organismo adulto, le MSC oltre che nel midollo osseo sono state identificate anche in altri organi come il cervello, la milza, il fegato, il rene, i polmoni, i muscoli, il timo, il pancreas (da Silva Meirelles et al., 2006) e inoltre nel sangue del cordone ombelicale (Erices et al., 2000).
I primi studi sulle cellule staminali del midollo osseo hanno evidenziato un asse tra midollo osseo e rene nei normali processi fisiologici di sostituzione di cellule tubulari senescenti e nella rigenerazione di alcuni tipi cellulari dando origine a cellule mesangiali, podociti e cellule endoteliali (Gupta et al., 2002; Ito et al., 2001; Poulsom et al., 2003). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule del midollo erano in grado non solo di migrare nel rene e partecipare al normale ricambio delle cellule epiteliali tubulari (Poulsom et al., 2001) ma anche di dare origine, in topi con lesioni tubulari acute indotte da trattamento con acido folico, a cellule tubulari renali (Fang et al., 2005). In pazienti affetti da necrosi tubulare acuta è stata documentata la presenza di cellule derivate dal midollo osseo nell'1% dei tubuli (Gupta et al., 2002).

L’insufficienza renale acuta

L'insufficienza renale acuta (IRA) è una sindrome caratterizzata dalla rapida perdita della funzione renale, con una diminuzione della velocità di filtrazione, accompagnata da azotemia.
L'insufficienza renale acuta colpisce circa il 7% dei pazienti ospedalizzati, specialmente quelli nelle unità di terapia intensive e la mortalità è piuttosto alta. Negli ultimi trent'anni nonostante i passi in avanti nelle terapie di supporto, i progressi clinici per migliorare la funzione renale e la mortalità, che si aggira ancora tra il 30 e l'80%, sono stati pochi. Sfortunatamente, al momento, non ci sono terapie farmacologiche che migliorino la sopravvivenza nell'uomo e nonostante alcune terapie con sostanze ormonali o farmacologiche siano risultate efficaci nei modelli animali esse si sono rivelate inutili nei protocolli clinici.
L'insufficienza renale acuta può svilupparsi in seguito ad insulti ischemici o nefrotossici con una tempistica e gravità che dipende dal tipo di danno. Tra le sostanze nefrotossiche vi è il cisplatino, un farmaco comunemente utilizzato nella terapia di tumori solidi quali ad esempio ovaio, testicolo, vescica e polmone che può indurre danno renale nel 25-35% dei pazienti trattati. Una delle caratteristiche del danno nefrotossico è la deplezione di ATP che è associata ad eventi intracellulari responsabili del danno delle cellule prossimali tubulari.
Alterazioni dell'actina del citoscheletro e la perdita dell'orletto a spazzola delle cellule tubulari sono seguiti da alterazioni delle proteine delle giunzioni cellulari, distacco tra cellula-cellula e cellula- substrato.
Cellule necrotiche o apoptotiche vengono rilasciate nel lume del tubulo e possono occluderlo aumentandone la pressione intratubulare e determinando una perdita di filtrato che contribuisce ulteriormente all'aggravarsi della patologia.

Le cellule mesenchimali staminali curano l’insufficienza renale acuta nel topo

Il nostro gruppo ha documentato per la prima volta che in un topi con IRA il trattamento con le cellule mesenchimali murine da midollo osseo (mMSC) contribuiva a ripristinare la funzione renale e a riparare la struttura tubulare (Morigi et al., 2004). Le cellule mesenchimali sono state isolate dal midollo osseo di topi maschi e iniettate in topi femmina con insufficienza renale acuta indotta da cisplatino (Morigi et al., 2004). In questi animali la funzione renale, misurata come azotemia nel siero, e la struttura renale peggioravano progressivamente raggiungendo un picco a 4 giorni (Figura 1, 2).

Gli animali con IRA da cisplatino, iniettati con le mMSC, avevano invece una funzione e struttura renale protetti per tutto il periodo di osservazione (Figura 1, 2). All'interno dei tessuti renali sono state identificate poche cellule positive al cromosoma Y e nell'epitelio tubulare queste cellule erano positive alla lectina Lens culinaris indicando una differenziazione in cellule epiteliali tubulari (Morigi et al., 2004). Abbiamo quantificato il numero di cellule mesenchimali che arrivavano al rene danneggiato e abbiamo osservato che a 4 giorni era piuttosto basso (1 cellula mMSC/105 cellule renali) (Imberti et al., 2007), e che solo l'8% delle cellule mesenchimali che si trovavano nel rene erano all'interno dei tubuli e acquisivano un fenotipo tubulare.
Questi dati suggeriscono che il differenziamento delle cellule staminali in cellule renali è un processo che avviene con una frequenza molto bassa e non può essere da solo responsabile dell'effetto benefico delle MSC.
Un dato importante del nostro studio dimostra che negli animali con IRA, il trattamento con le cellule mesenchimali induceva una marcata rigenerazione delle cellule tubulari endogene, valutata come positività al marcatore nucleare di proliferazione cellulare Ki-67 (Morigi et al., 2004).
Successivamente, altri gruppi hanno confermato, in altri modelli sperimentali di IRA quali quelli da glicerolo e da ischemia/riperfusione, l'effetto protettivo delle MSC (Herrera et al., 2004; Togel et al., 2005).
Questi risultati provano l'efficacia della terapia cellulare con le cellule staminali mesenchimali nel riparo del danno renale acuto. Questo effetto benefico probabilmente è dovuto alla capacità delle cellule staminali di raggiungere il tessuto renale e di produrre localmente fattori di crescita in grado di stimolare la proliferazione delle cellule residenti renali.

Le cellule mesenchimali staminali stimolano la rigenerazione del tessuto renale attraverso un'azione paracrina

Per comprendere quali potessero essere i meccanismi alla base dell'effetto renoprotettivo delle MSC in animali con IRA, abbiamo messo a punto in vitro un sistema di co-coltura di mMSC con cellule prossimali tubulari (PTEC) murine danneggiate da cisplatino (Imberti et al., 2007).
In questo sistema le mMSC proteggevano le PTEC dal danno indotto dal cisplatino inducendo la proliferazione delle cellule tubulari.
Tale proliferazione era mediata dall'insulin-like growth factor-1 (IGF-1), fattore espresso dalle MSC e mediatore di importanza riconosciuta nella rigenerazione del rene in modelli di insufficienza renale acuta (Ding et al., 1993; Miller et al., 1992). La co-coltura con mMSC trasfettate con "small interfering (si) RNA", utilizzati per bloccare la traduzione dell'RNA messaggero per l'IGF-1, risultava in una significativa diminuzione della proliferazione delle PTEC danneggiate e ad un aumento dell'apoptosi di queste cellule (Imberti et al., 2007). In animali con insufficienza renale acuta, l'infusione di mMSC trasfettate con siRNA specifici per IGF-1 limitava il loro effetto protettivo sulla funzione renale e sulla struttura tubulare (Imberti et al., 2007). L'effetto paracrino delle MSC nel rene è supportato da evidenze in un modello di ischemia/riperfusione nel ratto che il rilascio locale di fattori come VEGF, HGF e IGF-1 da parte delle MSC sia importante nel riparo del tessuto renale (Togel et al., 2007).
L'impiego di IGF-1 come approccio farmacologico nel trattamento dell'AKI è controverso. In alcuni studi sperimentali, l'IGF-1 somministrato per via sistemica aumentava la filtrazione e il flusso sanguigno renale (Hirschberg et al., 1991) e ripristinava la funzione renale e il riparo dei nefroni (Ding et al., 1993; Miller et al., 1992). In uno studio nei ratti invece è stato recentemente dimostrato che il trattamento con IGF-1 aumentava la risposta infiammatoria e il rischio di morte degli animali (Hladunewich MA, KI, 2003).
Due studi clinici hanno mostrato che l'iniezione di IGF-1 ricombinante umano non migliorava o accelerava il recupero della funzione renale in pazienti con insufficienza renale acuta (Hirschberg et al., 1999; Hladunewich et al., 2003). Tale mancanza di efficacia potrebbe essere imputabile al fatto che l'IGF-1 viene rapidamente legato da proteine circolanti per cui ha alta affinità e che la sua attività biologica viene così limitata, impedendo il suo rilascio al rene e quindi ai tubuli (Hirschberg et al., 1999; Jones and Clemmons, 1995). Il rilascio locale dell'IGF-1 ai tessuti danneggiati può superare questo problema come mostrato da lavori recenti in modelli di infarto del miocardio (Davis et al., 2006; Li et al., 2006). Nel nostro studio, il rilascio locale di IGF-1 da parte delle mMSC, reclutate al siti di danno dei tubuli renali potrebbe agire come potente strumento di rigenerazione inducendo proliferazione ed inibendo l'apoptosi delle cellule tubulari endogene.

Efficacia delle cellule staminali mesenchimali umane

I risultati positivi ottenuti con le MSC derivate dal midollo osseo murino rappresentano una valida base per una futura applicazione terapeutica nell'uomo. Con questo obiettivo, il nostro gruppo ha studiato l'efficacia delle cellule mesenchimali umane (human, hMSC) da midollo osseo, ottenute dal Dott. Martino Introna (Laboratorio di Terapia Cellulare e Genica "G.Lanzani", Ospedali Riuniti di Bergamo), nel modello di insuffficienza renale acuta indotta da cisplatino in topi immunodeficienti, NOD-SCID (Morigi et al., 2008). Le cellule mesenchimali staminali umane, iniettate 24 ore dopo la Somministrazione di cisplatino, riducevano, a 4 giorni, il danno delle cellule tubulari prossimali e miglioravano la funzione renale. A 7 giorni la terapia con hMSC diminuiva la mortalità del 50%. L'effetto benefico delle hMSC si manifestava nel tessuto renale attraverso una diminuzione delle cellule apoptotiche (Tabella), valutata con il saggio del TUNEL e mediante induzione della proliferazione delle cellule renali tubulari (Tabella), studiata con immunoistochimica del marcatore nucleare di proliferazione cellulare (PCNA). Un importante risultato che spiega ulteriormente l'azione protettiva delle cellule mesenchimali è da attribuirsi al mantenimento della microcircolazione renale. Infatti, attraverso una analisi morfometrica, eseguita su sezioni renali marcate con un anticorpo che riconosceva l'endotelio (MECA-32) abbiamo osservato che la densità di volume dell'endotelio e dei capillari peritubulari, ridotta nei reni di animali trattati con cisplatino, era ripristinata in animali trattati con le hMSC (Figura 3).

Funzionalmente questo stava a significare una migliore perfusione e probabilmente ossigenazione del tessuto. Il potenziale rigenerativo delle MSC da midollo osseo, riassunto in Figura 4, è stato chiaramente dimostrato nel modello animale e conferma che le MSC rappresentano una popolazione cellulare importante per future terapie cellulari e per una possibile applicazione clinica nei pazienti con insufficienza renale acuta.

Studi in corso

Allo scopo di identificare le cellule staminali più efficaci nel riparo del danno renale nell'IRA, stiamo studiando il potenziale delle cellule MSC ottenute dal sangue del cordone ombelicale (human cord blood, hCB), in collaborazione con la Dott.ssa Lorenza Lazzari (Cell factory,Terapia Cellulare e Criobiologia, Ospedale Maggiore Policlinico di Milano), per il trattamento dell'IRA in un modello murino da cisplatino. Dati preliminari mostrano che l'infusione di hCBMSC in topi immunodeficienti con IRA migliora la funzione renale, il danno tubulare e prolunga la sopravvivenza degli animali. Le hCB-MSC trapiantate si localizzano in modo predominante nelle aree peritubulari, limitano le alterazioni dei capillari e l'infiltrazione di neutrofili. Inoltre, le cellule staminali limitano lo stress ossidativo e l'apoptosi delle cellule tubulari mentre ne aumentano la proliferazione. L'effetto renoprotettivo delle hCB-MSC è ulteriormente confermato dalla loro capacità di indurre il fattore Akt, una chinasi che gioca un ruolo chiave come mediatore di segnali per la sopravvivenza cellulare, nelle cellule tubulari. In esperimenti di co-coltura, l'evidenza che le hCB-MSC inibiscono la produzione di IL-1β e TNF-α nelle cellule prossimali tubulari danneggiate da cisplatino indica una azione anti-infiammatoria del trattamento con cellule staminali.

Conclusioni

Le MSC derivate dal midollo osseo e dal cordone ombelicale possono potenzialmente rappresentare una valida alternativa per una futura applicazione terapeutica nell'uomo. Recenti evidenze cliniche hanno mostrato che le MSC da midollo e dal sangue del cordone ombelicale sono sicure ed efficaci nel trattamento nell'uomo dell'infarto del miocardio, di malattie ematologiche, neurologiche e nella malattia di Buerger (Harris, 2008; Kim et al., 2006; Macmillan et al., 2008). Il potenziale renotropico e rigenerativo delle MSC è stato chiaramente dimostrato e può avere un'enorme implicazione nel trattamento dell'insufficienza renale acuta nell'uomo. D'altra parte, tale malattia si sviluppa in breve tempo, e quindi l'utilizzo di MSC da midollo autologo, isolate dallo stesso paziente, non è attuabile poichè occorrono molti giorni per isolarle ed espanderle in vitro. Per questo sembra più fattibile l'uso di cellule staminali allogeniche, preventivamente isolate da donatori, fatte crescere in vitro e poi congelate. MSC da midollo osseo o dal sangue del cordone ombelicale hanno buone capacità di crescita in vitro e proprietà immunologiche che le rendono ben tollerate in ambiente allogenico (Aggarwal and Pittenger, 2005; Hao et al., 1995; Le Blanc et al., 2003; Schwinger et al., 1998). Questa loro peculiarità rende le MSC molto interessanti nell'ottica di possibili terapie cellulari senza l'uso combinato di farmaci immunosoppressori.

Dott.ssa Marina Morigi
Ph.D., Head, Laboratory of Cell Biology and Xenotransplantation, Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Bergamo

Dott.ssa Barbara Imberti
Ph.D., Senior Researcher, Laboratory of Cell Biology and Xenotransplantation, Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Bergamo

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