da Leadership Medica n. 274 del 2009

Abstract

L'angiotensina II (Ang II), prodotto principale del sistema renina-angiotensina (SRA), ha un ruolo nell'eziologia dell'ipertensione e nella patofisiologia delle malattie cardiache e renali nell'uomo (1). Altre funzioni dell'angiotensina II includono effetti sulla risposta immune, sull'infiammazione, sulla crescita e la proliferazione cellulare (2), effetti in gran parte mediati dai recettori AT₁. In questo studio, abbiamo dimostrato che la soppressione nel topo del gene Agtr1a che codifica per il recettore di tipo 1A dell'angiotensina II (AT_1A) si traduce in un significativo prolungamento della durata della vita. Topi geneticamente modificati così che non esprimano il recettore AT_1A sulle membrane cellulari (AT_1A-/-) sviluppavano meno danno vascolare e cardiaco. L'assenza del recettore AT1A proteggeva aorta e rene dal danno ossidativo. Il rallentamento del processo di invecchiamento era associato ad aumento del numero di mitocondri e dell'espressione nel rene di geni legati alla longevità Nampt1 e sirtuina 3 (SIRT 3) (3). Studi in vitro eseguiti in parallelo dimostravano che l'angiotensina II regolava negativamente l'mRNA di SIRT3, effetto prevenuto dall'antagonista del recettore AT₁. Questi risultati dimostrano una nuova funzione di Ang II che, legandosi al recettore AT₁, media il processo di invecchiamento. Spegnendo il recettore di tipo 1 dell'angiotensina II si attenua lo stress ossidativo e si aumenta l'espressione di geni della longevità, Nampt1 e SIRT3. Questi dati suggeriscono che nell'uomo, i sartani, antagonisti recettoriali di AT₁, potrebbero proteggere gli organi dall'invecchiamento.

Introduzione

Il sistema renina-angiotensina (SRA) ha un ruolo fondamentale nella regolazione della pressione sanguigna e nella fisiologia del sistema cardiovascolare (1).
Il suo ruolo nella patogenesi di diversi stati di malattia è stato ben documentato e i componenti di SRA rappresentano importanti obiettivi farmacologici nel- le condizioni di ipertensione e nelle malattie cardiovascolari. L'angiotensina II (Ang II) agisce legandosi a due classi di recettori farmacologicamente distinti (AT₁ e AT₂) (4). L'effetto di AngII di aumentare la pressione sanguigna e di promuovere diverse patologie è mediato dai recettori AT₁, i quali sono espressi in diversi organi, incluso il cuore, i vasi sanguigni, le ghiandole surrenali e i centri nel cervello che controllano il cuore (2). In questo studio abbiamo identificato un nuovo ruolo di AngII che, tramite i recettori AT₁, agisce come mediatore dei normali processi di invecchiamento. Inoltre, i nostri studi suggeriscono che l'inibizione dei segnali del recettore AT₁ attenua la senescenza degli organi e prolunga la durata della vita nell'animale da esperimento.

Risultati

Lo studio sperimentale è stato condotto in 20 topi omozigoti privi del recettore AT_1A - la maggiore isoforma del recettore AT₁ nel topo omologa al recettore umano AT₁ 5 - e in 10 topi controllo. Gli animali mancanti del recettore AT_1A (knock out per AT_1A) vivevano molto più a lungo rispetto ai controlli (figura 1).

A 29 mesi, quando tutti gli animali di controllo erano morti, 17 topi KO per AT_1A (85%) erano ancora vivi e sopravvivevano per altri sette mesi. Il confronto delle curve di sopravvivenza mostrava una significatività statistica tra i gruppi (P<0.0001). La durata di vita dei topi KO per AT_1A era circa il 26% più lunga rispetto ai topi di controllo.
È noto che la restrizione calorica e la ridotta dimensione corporea sono associate ad un aumento della longevità (6-7). Per verificare se l'assenza del recettore AT_1A influenzasse l'assunzione di cibo e il peso corporeo, il consumo quotidiano era monitorato a 19 e 21 mesi di età. L'assunzione di cibo era identica tra i topi AT_1A-/- e i controlli. Il peso corporeo era lievemente ma non significativamente ridotto negli AT_1A-/- rispetto ai rispettivi controlli fino a 18 mesi, quando i due gruppi diventavano indistinguibili. I topi AT_1A-/- mostravano una normale attività motoria, dimostrata dalla loro abilità di eseguire il test della barra rotante, che misura il tempo di permanenza in equilibrio su un cilindro rotante. L'incidenza di adenocarcinoma era paragonabile negli animali privi del recettore e in quelli di controllo ed era del 10-15%. Non era correlata al genotipo ed era ridotta rispetto a quella precedentemente riportata in letteratura (circa 30%)(8).
Alla fine dell'esperimento cuore, aorta, pancreas, rene, fegato, milza e cervello erano stati prelevati per valutare le conseguenze patofisiologiche della mancanza del recettore AT_1A sulla struttura degli organi. Le differenze morfologiche tra AT_1A-/- e animali di controllo erano osservabili nel cuore, nell'aorta e nel pancreas. Il rapporto tra peso del cuore/peso corporeo e la massa ventricolare sinistra erano comparabili tra i topi AT_1A-/- e i controlli. Non si osservavano differenze nel numero di cardiomiociti in sezioni trasversali del ventricolo sinistro. Al contrario, l'area della sezione trasversale del miocita, indice della grandezza del miocita stesso, era significativamente ridotta nei topi AT_1A-/- rispetto ai controlli (figura 2 - sotto) così come la fibrosi del tessuto cardiaco. L'analisi morfologica di sezioni seriate di cuore mostrava che la deposizione di collagene nello spazio interstiziale era ridotta negli animali AT_1A -/- (figura 2). I topi AT_1A -/- non sviluppavano lesioni nell'aorta. Al contrario, il 50% degli animali di controllo anziani mostravano un aumento delle lesioni aterosclerotiche due volte maggiore rispetto agli animali AT_1A -/-.

Mentre il pancreas degli animali AT_1A -/- appariva morfologicamente normale, gli animali di controllo manifestavano aggregati linfoidi che interessavano una significativa porzione di isole. Gli aggregati raramente penetravano all'interno delle isole e non erano associati a necrosi. Per determinare se l'insulite nei topi controllo risultava in una perdita delle cellule è stata eseguita una colorazione per l'insulina. L'entità della colorazione per l'insulina era identica tra i topi AT_1A -/- e i controlli, indicando così un numero comparabile di cellule secernenti insulina nei due gruppi. Non c'erano differenze nei livelli di glucosio a digiuno tra animali AT_1A -/- e controlli. L'escrezione urinaria di proteine si manteneva entro i limiti di normalità durante lo studio sia negli AT_1A -/- che nei controlli. Il volume urinario di 24 ore era relativamente costante in entrambi i gruppi ma era più elevato nei topi AT_1A -/- rispetto al gruppo di animali di controllo in linea con un alterato meccanismo di concentrazione delle urine precedentemente descritto in questi animali (9). Durante lo studio la funzione renale non cambiava ed era comparabile tra i gruppi. Lo stress ossidativo è il principale fattore che contribuisce all'invecchiamento. Negli insetti e nei roditori, le mutazioni di geni legati alla resistenza agli stress ambientali allungano la durata della vita. La principale fonte cellulare di specie reattive all'ossigeno sono i mitocondri, che sono anche particolarmente sensibili al danno ossidativo. Dati della letteratura dimostrano che i tessuti prelevati da animali anziani possiedono un numero ridotto di mitocondri, che presentano diverse alterazioni funzionali incluso l'aumento di superossido, la produzione di H2O2 e una riduzione della produzione di energia (10) . Le cellule del tubulo prossimale renale possiedono un gran numero di mitocondri e sono altamente dipendenti dalla produzione di energia mitocondriale per le proprie funzioni (11) . Nei topi controllo, la densità numerica dei mitocondri nelle cellule del tubulo prossimale era significativamente ridotta con l'età (P<0.01) rispetto agli animali giovani di 2 mesi (figura 3 - sotto). La mancanza del recettore AT1A proteggeva gli animali dalla perdita dei mitocondri con l'età (P<0.01, figura 3).

Questi risultati sono in linea con descrizioni precedenti che hanno mostrato un effetto benefico dell'inibitore dell'enzima di conversione per Angiotensina II nel preservare i mitocondri in animali anziani (12) . L'angiotensina II aumenta la produzione vascolare di anione superossido (O2-) e induce l'uncoupling dell'enzima ossido-nitrico-sintetasi endoteliale, il quale produce radicali dell'ossigeno invece che monossido d'azoto nel tessuto vascolare. Il monossido d'azoto, interagendo con l'anione superossido, forma perossinitrito, anione citotossico che inibisce il trasporto di elettroni a livello mitocondriale (13). L'espressione di nitrotirosina, un indicatore della produzione di perossinitrito, era aumentata nell'aorta e nel rene degli animali anziani rispetto a topi di 2 mesi di età (figura 4 - sotto).

Al contrario, il segnale di nitrotirosina era ridotto nell'aorta e nel rene dei topi AT1A-/- rispetto ai controlli anziani e aveva valori paragonabili a quelli di topi giovani (figura 4), suggerendo che l'assenza del recettore AT₁ protegge i tessuti dal danno ossidativo. Le sirtuine mitocondriali (SIRT) 3 e 4, membri della famiglia delle deacetilasi istoniche che usano NAD+ come co-substrato, sembrano giocare un ruolo nella longevità (14) poiché mantengono la vitalità mitocondriale. In un recente studio condotto in una condizione di restrizione calorica, l'aumento dei livelli di NAD+ nei mitocondri conseguente all'aumentata espressione di Nampt1 proteggeva le cellule dalla morte attraverso l'attivazione di SIRT3 e 4(3). Ci siamo domandati se gli alti livelli di AngII misurati nei topi AT_1A-/- inducevano il gene Nampt il quale a sua volta poteva prevenire la morte mitocondriale provocata dall'invecchiamento. I livelli di trascrizione di Nampt1 e SIRT3 erano notevolmente aumentati nei rene degli animali AT_1A -/- rispetto ai controlli (figura 5). Per determinare la relazione tra AngII e SIRT3, cellule epiteliali del tubulo prossimale di topo sono state esposte ad AngII in presenza o assenza di un antagonista recettoriale per AngII, candesartan, e l'espressione di mRNA di SIRT3 è stata valutata con PCR real time. La riduzione dei livelli di mRNA di SIRT3 osservata dopo AngII era prevenuta da candesartan (figura 5), suggerendo un legame biochimico tra AngII e SIRT3 tramite il recettore AT1. Complessivamente questi risultati indicano che Nampt1 e SIRT3 promuovevano la vitalità mitocondriale contribuendo a prolungare la sopravvivenza.

Discussione

In questo studio abbiamo dimostrato che topi privi del recettore di tipo 1 dell'angiotensina II (AT_1A -/-) vivevano più a lungo, sviluppavano meno danno vascolare e l'assenza del recettore AT_1A proteggeva cuore, aorta e rene dal danno ossidativo. Il rallentamento del processo di invecchiamento e il marcato prolungamento della durata della vita erano associati ad aumento del numero di mitocondri e dell'espressione dei geni legati alla sopravvivenza Nampt1 e sirtuina 3 (SIRT3) (3) nel rene. Il prolungamento della durata della vita qui descritto è comparabile a quello dei topi privi del recettore per il fattore insulinico di crescita 1 (IGF-1) (15) o della isoforma p66 del proto-oncogene Sch, la molecola di trasduzione più rilevante del recettore IGF-1 (16) . Altri studi hanno dimostrato che l'aumento della sopravvivenza indotto dal resveratrolo (17) - una piccola molecola presente nel vino rosso che attiva SIRT1 e mima gli effetti anti-invecchiamento della restrizione calorica - si associa ad un aumento del numero di mitocondri (17) ed è dipendente da un'aumentata espressione di sirtuine (18) . Le sirtuine possono quindi essere considerate un potenziale obiettivo terapeutico per rallentare i processi di invecchiamento e per favorire l'estensione della vita. Questo è in linea con altre scoperte che dimostrano che omologhi di Sir2 prolungano realmente la durata della vita in nematodi e insetti mimando l'effetto di allungamento della vita ottenuto con la restrizione calorica (18) . Attivatori di SIRT1 migliorano la resistenza insulinica e incrementano la capacità mitocondriale nel diabete sperimentale (19) . Tuttavia, la manipolazione della via delle sirtuine nell'uomo non è al momento fattibile. Al contrario, gli antagonisti del recettore di tipo 1 di AngII, i sartani, sono sicuri, ben tollerati per l'uso cronico e sono usati come farmaci chiave nel combattere l'ipertensione e proteggere il rene e il cuore dal danno cronico (20) . Il nostro studio pone le basi per esplorare la possibilità che gli antagonisti del recettore AT₁ prevengano il deterioramento degli organi che si associa all'invecchiamento riducendo lo stress ossidativo e aumentando l'espressione di SIRT3. Ulteriori studi sono necessari per conoscere meglio il recettore AT₁ dell'uomo e capire se la sua funzione sia analoga a quella del recettore nell'animale.

Dott.ssa Ariela Benigni
Ph.D., Head, Department of Molecular Medicine
Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Bergamo

Bibliografia

1 Coffman, T. M. and Crowley, S. D., Kidney in hypertension: guyton redux. Hypertension 51 (4), 811 (2008).
2 Kim, S. and Iwao, H., Molecular and cellular mechanisms of angiotensin II-mediated cardiovascular and renal diseases. Pharmacol Rev 52 (1), 11 (2000).
3 Yang, H. et al., Nutrient-sensitive mitochondrial NAD+ levels dictate cell survival. Cell 130 (6), 1095 (2007).
4 Ito, M. et al., Regulation of blood pressure by the type 1A angiotensin II receptor gene. Proc Natl Acad Sci U S A 92 (8), 3521 (1995).
5 Oliverio, M. I. et al., Reduced growth, abnormal kidney structure, and type 2 (AT2) angiotensin receptormediated blood pressure regulation in mice lacking both AT1A and AT1B receptors for angiotensin II. Proc Natl Acad Sci U S A 95 (26), 15496 (1998).
6 Weindruch, R., Walford, R. L., Fligiel, S., and Guthrie, D., The retardation of aging in mice by dietary restriction: longevity, cancer, immunity and lifetime energy intake. J Nutr 116 (4), 641 (1986).
7 Brown-Borg, H. M., Borg, K. E., Meliska, C. J., and Bartke, A., Dwarf mice and the ageing process. Nature 384 (6604), 33 (1996).
8 Haines, D. C., Chattopadhyay, S., and Ward, J. M., Pathology of aging B6;129 mice. Toxicol Pathol 29 (6), 653 (2001).
9 Oliverio, M. I. et al., Abnormal water metabolism in mice lacking the type 1A receptor for ANG II. Am J Physiol Renal Physiol 278 (1), F75(2000).
10 Sohal, R. S. et al., Oxidative damage, mitochondrial oxidant generation and antioxidant defenses during aging and in response to food restriction in the mouse. Mech Ageing Dev 74 (1- 2), 121 (1994).
11 de Cavanagh, E. M. et al., Enalapril and losartan attenuate mitochondrial dysfunction in aged rats. Faseb J 17 (9), 1096 (2003).
12 Ferder, L. et al., Effects of angiotensin- converting enzyme inhibition on mitochondrial number in the aging mouse. Am J Physiol 265 (1 Pt1), C15 (1993).
13 Radi, R., Beckman, J. S., Bush, K. M., and Freeman, B. A., Peroxynitriteinduced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys 288 (2), 481 (1991).
14 Christensen, K., Johnson, T. E., and Vaupel, J. W., The quest for genetic determinants of human longevity: challenges and insights. Nat Rev Genet 7 (6), 436 (2006).
15 Holzenberger, M. et al., IGF-1 receptor regulates lifespan and resistance to oxidative stress in mice. Nature 421 (6919), 182 (2003).
16 Migliaccio, E. et al., The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals. Nature 402 (6759), 309 (1999).
17 Baur, J. A. et al., Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature 444 (7117), 337 (2006).
18 Howitz, K. T. et al., Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425 (6954), 191 (2003).
19 Milne, J. C. et al., Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes. Nature 450 (7170), 712 (2007).
20 Remuzzi, G., Schieppati, A., and Ruggenenti, P., Nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med 346, 1145 (2002).